Fluconazol como alternativa terapéutica en infecciones asociadas a Mycobacterium tuberculosis / Fluconazole as a therapeutic alternative in infections associated with Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) es un microorganismo cuya importancia como agente infeccioso ha permanecido a través de los años, pero que se ha convertido en una emergencia y un grave problema de salud pública, como respuesta a la evolución en su comportamiento ante los antimicrobianos de primera línea para su tratamiento y al surgimiento de cepas multi-resistentes, lo que amerita el uso de alternativas terapéuticas que permitan su control. El objetivo del trabajo fue evaluar el comportamiento in vitro de M. tuberculosis ante el antimicótico fluconazol, para su posible uso como alternativa terapéutica. Para ello, se evaluaron 6 cepas de M. tuberculosis: 2 resistentes a rifampicina, 2 resistentes a isoniazida y 2 sensibles a ambos antimicrobianos, Se utilizó el método de Concentración Inhibitoria Mínima, utilizando la técnica en microplaca con Azul de Alamar y la técnica de dilución en tubo. Ambas metodologías mostraron sensibilidad ante bajas concentraciones de fluconazol (0,0625 µg/ml). Todas las cepas fueron sensibles a la combinación fluconazol/isoniazida; mientras que, a la combinación fluconazol/rifampicina mostraron resistencia, indicando el efecto antagónico de la rifampicina sobre el fluconazol. Los resultados permiten concluir y sugerir el posible uso terapéutico del fluconazol ante las infecciones asociadas por M. tuberculosis.

Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) is a microorganism whose importance as an infectious agent has remained over the years but which has become a recent emergency and a serious public health problem in response to the evolution in its behavior against first-line antimicrobials, for its treatment and the emergence of multi-resistant strains, which require the use of therapeutic alternatives that allow its control. The objective of the work was to evaluate the in vitro behavior of M. tuberculosis before the antifungal agent fluconazole, for its possible use as a therapeutic alternative. To this, six strains were evaluated M. tuberculosis: 2 resistants to rifampicin, 2 resistants to isoniazid and 2 sensitive to both antimicrobials. We used the method of Minimum Inhibitory Concentration, using the microplate technique with Alamar Blue and the tube technique. Both methodologies showed sensitivity to low concentrations of fluconazole (0.0625 µg/ml). All strains were sensitive to the fluconazole / isoniazid combination; whereas, when exposed to the fluconazole / rifampicin combination, the strains showed resistance, indicating the antagonistic effect of rifampicin on fluconazole. The results allow us to conclude and suggest the possible therapeutic use of fluconazole against infections associated with M. tuberculosis.

Detección de la mutación S315T en el gen katg como estrategia para identificación de Mycobacterium tuberculosis resistente a isoniacida en un laboratorio de referencia / Detection of S315T mutation in the katg gene as a strategy for identification of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis in a reference laboratory

Introduction: The emergence of strains of Mycobacterium tuberculosis resistant to drugs is a public health problem. Aim: To characterize the resistance to isoniazid (INH) in M. tuberculosis. Methods: Phenotypic and genotypic methods were used to determine the contribution of mutations at 315 codon of katG gene to the phe-notypic expression of resistance. The analysis of susceptibility to antibiotics was performed by the proportional method of Canetti and nitrate reductase method.Genotypic analysis of INH resistance was performed by PCR-RFLP. Results: 193 strains of M. tuberculosis from patients with respiratory symptoms were analyzed. Nineteen (9.8%) strains resistant to INH were identified, of which 12 (63.2%) showed resistance to other drugs. Genotypic analysis allowed to detect the mutation S315T in the katG gene in 15 of 17 strains phenotypically resistant to INH, showing a sensitivity of 88.24%, 100% specificity, 100% positive predictive value, 92% negative predictive value and high concordance with phenotypic methods (kappa = 0.85 (p < 0.01). Conclusion: The S315T mutation in the katG gene is the predominant mechanism of INH resistance in our circulating strains. This feature could be used as a rapid diagnostic tool with potential to detect at least 88% of isoniazid resistant strains, with great impact on the therapeutic management of patients.

Introducción: La emergencia de cepas de Mycobacterium tuberculosis multi-resistentes a antimicrobianos constituye un problema de salud pública. Objetivo: Caracterizar la resistencia a isoniacida (HIN) en cepas de M. tuberculosis. Métodos: Se aplicaron métodos fenotí-picos y genotípicos para determinar la contribución de mutaciones en el codón 315 del gen katG a la expresión fenotípica de resistencia. El análisis fenotípico de susceptibilidad a antimicrobianos se realizó por métodos de las proporciones de Canetti y nitrato reductasa. El análisis genotípico se realizó por RPC-PLFR. Resultados: Se analizaron 193 cepas de M. tuberculosis aisladas de pacientes sintomáticos respiratorios. Se identificaron 19 (9,8%) cepas resistentes a HIN, de las cuales, 12 (63,2%) exhibieron resistencia a otros antimicrobianos. El análisis genotípico permitió detectar la mutación katG S315T en 15/17 cepas fenotípicamente resistentes a HIN, exhibiendo una sensibilidad de 88,24%, especificidad de 100%, valor predictor positivo de 100%, valor predictor negativo de 92% y alta concordancia al comparar con los métodos fenotípicos (kappa = 0,85 (p < 0,01). Conclusión: La mutación S315T en el gen katG representa un mecanismo de desarrollo de resistencia a HIN predominante en las cepas circulantes en nuestro medio, característica que podría ser utilizada como herramienta diagnóstica rápida para detectar al menos 88% de las cepas resistentes a isoniacida, con gran impacto en el manejo terapéutico de los pacientes.

Identificación diferencial de aislados clínicos de mycobacterium tuberculosis y mycobacterium bovis por un ensayo de rcp múltiple / Differential Identification of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis Clinical Isolates by Multiplex PCR Assay

Mycobacterium tuberculosis es el agente causal de tuberculosis en humanos, sin embargo, la transmisión zoonótica de Mycobacterium bovis de animales a humanos, principalmente a individuos inmunocomprometidos, es de gran impacto en salud pública. La necesidad de diseñar métodos rápidos y precisos que permitan diferenciar entre M. tuberculosis y M. bovis ha conducido al desarrollo de estrategias de identificación genotípica. El objetivo de este estudio fue evaluar el poder discriminatorio de un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa en formato múltiple para diferenciar entre aislados clínicos de M. tuberculosis y M. bovis. Se estandarizaron condiciones para amplificación simultánea con oligonucleótidos dirigidos a secuencias de genes Rv0577 y Rv1510. Rv0577 es específico de micobacterias del Complejo M. tuberculosis y Rv1510 se localiza en regiones polimórficas (RD4) del genoma de cepas del complejo M. tuberculosis, ausentes en M. bovis y M. bovis BCG, permitiendo diferenciar entre estas dos especies del complejo M. tuberculosis. Para evaluar la especificidad del ensayo se analizaron 46 aislados clínicos. El amplicón correspondiente a Rv0577 se detectó en todos los aislados clínicos del complejo M. tuberculosis, mientras que el producto de 1033 pb Rv1510 (RD4), se observó exclusivamente en M. tuberculosis, pero no en M. bovis, ni en M. bovis BCG, demostrando la especificidad de este ensayo de RCP para identificar micobacterias del complejo M.tuberculosis y diferenciar entre M. tuberculosis y M. bovis en una única reacción de amplificación. Dada la especificidad del ensayo, éste puede ser aplicado para la identificación y diferenciación de micobacterias del complejo M. tuberculosis en muestras clínicas, para hacer control de calidad de productos derivados de animales con sospechas de infección y desarrollar estudios a gran escala de transmisión zoonótica de M. bovis en poblaciones vulnerables.

Mycobacterium tuberculosis is the causal agent of tuberculosis in humans, however, the zoonotic transmission of Mycobacterium bovis from animals to humans, mainly immunocompromised individuals, is of great impact in public health. The necessity to design rapid and precise methods to differentiate between M. tuberculosis and M. bovis has lead to the development of strategies of genotypic identification. The aim of this study was to evaluate the discriminatory power of a multiplex PCR assay to differentiate between M. tuberculosis and M. bovis clinical isolates. Conditions for simultaneous amplification with oligonucleótidos targeted Rv0577 and Rv1510 genes sequences were standardized. Rv0577 is specific of M. tuberculosis complex mycobacteria and Rv1510 is located in polymorphic regions (RD4) of the mycobacterial genome of M. tuberculosis complex, but is absent in M. bovis and M. bovis BCG, allowing to differentiate between M. tuberculosis complex strains. To evaluate the specificity of the PCR assay, 46 clinical isolates were analyzed. The amplicon from Rv0577 gene was detected in all of the clinical isolates from M. tuberculosis complex, whereas the 1033 pb product from Rv1510 (RD4), was exclusively observed in M. tuberculosis and was absent in M. bovis and M. bovis BCG, showing the specificity of this PCR assay to identify mycobacteria of the M. tuberculosis complex and to differentiate between M. tuberculosis and M. bovis in a single-step assay. This multiplex PCR assay can be applied to the identification and differentiation of mycobacteria of M. tuberculosis complex in clinical samples, to the quality control of products derived from animals with infection suspicions and to develop studies on great scale of zoonotic transmission of M. bovis in susceptible populations.